大脑是一个巨复杂系统，数百种不同类型、数量巨大的神经元通过彼此联接构成复杂的信息处理网络，发挥其生理功能。获取各种类型神经元在全脑范围内的分布、神经元完整的形态投射及其神经活动的动态特征，对理解神经环路的组织规律与运行机制具有重要意义。近年来，科学家们在单神经元水平的全脑神经环路结构解析，以及活体荧光成像观测单神经元活动方面都取得了长足的进步。然而，如何在单细胞分辨水平融合活体神经活动与全脑神经联接结构，对同一个特定类型的神经元获取其活动信号，及其在全脑范围的精细轴突投射仍然面临巨大的挑战。
2022年10月13日，骆清铭院士团队在《Advanced Science》在线发表论文“Mapping the function of whole-brain projection at the single neuron level”，建立了能对特定类型神经元进行单细胞分辨的神经活动成像，并绘制出同一个神经元在全脑范围精细轴突投射的方法。该方法结合遗传型功能探针稀疏标记、活体双光子荧光成像、高清fMOST全脑精细结构成像和跨模态细胞匹配等多项技术，能获取同一神经元的神经活动与全脑投射信息，并在单神经元水平探索了功能偏好与轴突投射特性的关系。
图1 Advanced Science 在线发表的研究论文
研究采用rAAV体系的二元表达系统，用遗传型钙探针GCaMP6稀疏标记神经元，通过活体钙成像方法，记录清醒小鼠神经元的视觉功能响应；利用高清荧光显微光学切片断层成像技术（High-definition fluorescent micro-optical sectioning tomography, HD-fMOST），获取GCaMP6标记神经元的全脑解剖形态和位置信息；通过项目组开发的方法实现跨模态细胞匹配，整合活体钙成像与高分辨率的全脑结构成像的信息，得到单神经元水平全脑投射的功能注释（functional annotation of whole-brain projection at the single neuron level, FAWPS)（图2），由此建立了获取同一神经元的功能响应特征和轴突全脑投射信息的方法。
图2 FAWPS的获取流程示意。（A）清醒小鼠在视觉刺激下的双光子活体成像示意图。（B）GCaMP6稀疏标记神经元的活体双光子成像。（C）HD-fMOST全脑成像系统示意图。（D）HD-fMOST全脑成像获取的冠状面图像。PI（红色）/GCaMP6（绿色）。（B）与（D）为同一鼠脑。（E~J）同一个神经元的功能响应与全脑投射。（E）视觉刺激诱导的钙响应曲线。（F）细胞匹配，来自同一神经元的双光子（左）与fMOST图像（右）（G）功能响应特性分析的示例。左：R2，时空频率偏好性；SF，空间频率；TF，时间频率。右：OSI，方位偏好性。（H）单神经元全脑投射的示例。虚线框放大图（I/J）。颜色代表投射靶区
FAWPS为单神经元水平研究轴突的全脑投射与功能之间的联系奠定了基础。将该方法应用于小鼠视觉皮层2/3层神经元，初步探究了神经元对运动视觉的偏好性与全脑投射特征之间的关联。结果显示，轴突投射基序模式与视觉运动的频率偏好相关；而投射到次级运动皮层（MOs）的轴突长度与方位偏好特性相关。提示投射基序定义的神经元可能形成功能特异的信息流，以及在特定投射区域中的投射强度可能与神经信息的清晰度有关。这一结果为探索神经元的功能/投射分型提供了新思路。
这是一个全新的尝试，实现功能探针标记神经元的全脑投射追踪。该研究中遗传型功能探针是连接同一个神经元的功能与全脑投射成像的桥梁。具体解决了遗传功能探针的稀疏标记、荧光增强和信噪比提升等技术难题。精细结构成像结果证实了GCaMP6的轴突标记与膜定位蛋白类似，且轴突信号的信背比与已发表的GFP信号相当，从而确保了单神经元轴突完整重建的可靠性。这些研究共同证实了遗传功能探针不仅能用于功能记录，也能用作全脑精细结构表征。
该方法是一个易于推广的方案，在操作简便性和扩展性上具有优势，潜在应用范围更广。遗传型探针结合分子类型特异的标记方法，能获得细胞类型特异的FAWPS；同时，该方法也有潜力与其他遗传型功能探针相结合，探索更多功能信息与投射的关联。
这项工作由院骆清铭院士团队完成，历时六年多，具有交叉学科特点的研究团队紧密合作，并得到国内多家单位的友情支持和帮助。周伟副教授与博士生柯珊珊为并列第一作者，李鹏程教授、周伟副教授、孙文智教授（北京脑中心，首都医科大学）和李安安教授为并列通讯作者；李文伟、袁菁教授、李向宁教授、金锐、贾雪艳、江涛博士、代子民、何冠男、方志巍、史良、张琪、龚辉教授、骆清铭教授为共同作者。该研究得到国家自然科学基金重大项目等资助。
论文连接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202202553
