2024年10月29日，《Nature Communications》在线发表华中科技大学武汉光电国家研究中心生物医学光子学研究部/华中科技大学生物医学光子学教育部重点实验室/海南大学付玲团队、海南大学骆清铭团队的研究论文“Supercontinuum-tailoring multicolor imaging reveals spatiotemporal dynamics of heterogeneous tumor evolution”。这项研究创建了一种名为“超连续谱裁剪双光子显微镜”的成像技术，仅用单束激光即可实现9种荧光观测目标的实时同步成像，突破了活体双光子成像的“颜色极限”。该技术具有高时空分辨、高稳定性和低损伤等优势，在活体条件下实现了对异质性肿瘤演进的时空动态过程的长时程、纵向的高质量观测。
癌症生态系统极为复杂，由具有不同基因型和表型特征的多个肿瘤亚克隆组成。克隆异质性的肿瘤需不断演进并适应来自周围环境的选择性压力，终将导致肿瘤恶化与治疗失败。然而，我们对异质性肿瘤演进的时空动态过程和相关生物事件的了解仍然有限，这在很大程度上是因为在活体条件下实施多目标纵向成像存在困难。光谱重叠问题限制了不同颜色荧光团对多个目标进行标记的可行性，成像系统调谐或耦合的稳定性问题以及光毒性的固有风险也进一步阻碍了多色成像技术在活体的成功应用。因此，活体显微成像技术面临的关键挑战是突破“颜色极限”，在确保低损伤和低光漂白的同时，有效、稳定地激发和区分更多的荧光团，从而实现对肿瘤演进过程中的动态生物事件的多目标纵向观测。
为此，研究团队开发出了一种基于超连续谱裁剪的双光子显微成像技术（Supercontinuum-tailoring two-photon microscope，SCT-TPM）。SCT-TPM能针对活体观测目标的荧光激发和发射光谱，设计并产生波长为700-900 nm的超连续谱光源，通过飞秒脉冲整形器调制超连续谱的相位，控制双光子吸收的非线性过程，实现多种荧光观测目标的激发复用。如图1所示，通过超连续谱光谱和相位的裁剪，以及自主研制的光谱解混算法NMF，SCT-TM可在3.9 s内完成对9种荧光团的同步成像。
相较于传统活体成像技术，SCT-TPM 具有如下优势：（1）双光子激发复用能对更多荧光团成像，在活体动物模型中可同步观测九个不同的目标；（2）超连续谱的相位调制能提高多色双光子成像的速度，以秒级速度捕捉多目标的快速生物学事件；（3）单束激发光能实现多色成像点扩散函数的空间配准，确保了多色成像的高空间分辨率和稳定性；（4）具有相对较低的光损伤，能在活体动物模型中进行连续数天的纵向成像。
图1. SCT-TPM原理示意图
利用SCT-TPM技术，研究团队在活体荷瘤鼠模型中可视化了克隆异质性的肿瘤演进的时空动态过程。SCT-TPM可对肿瘤微环境中的8个对象进行同步成像，包括6种不同荧光标记的肿瘤亚克隆细胞、宿主来源的EGFP细胞和肿瘤血管网络（图2）。通过SCT-TPM，可观测到肿瘤与宿主免疫相互作用过程中的一系列关键生物事件，如免疫细胞对肿瘤细胞的围攻杀伤、肿瘤细胞裂解和分泌囊泡、肿瘤细胞增殖和迁移，以及肿瘤微血管网络的紊乱状态等。此外，SCT-TPM还揭示了源于同一亲本的肿瘤亚克隆在肿瘤-宿主博弈过程中表现出了不同的增殖和迁移潜能，以及对免疫反应的不同敏感性。在宿主免疫的持续选择压力下，肿瘤可能不断地进化，产生具有更强增殖、迁移或免疫耐受潜能的亚克隆谱系，终将导致肿瘤发展到不可逆转的严重恶化状态。
图2. SCT-TPM实时追踪异质性肿瘤演进的时空动态过程
这项研究得到了国家自然科学基金、协同创新中心基金、国家重点研发计划以及武汉光电国家研究中心开放课题项目的资助。文章的第一作者为华中科技大学武汉光电国家研究中心生物医学光子学研究部高秀娟博士后、黄歆媛博士和陈忠云博士，通讯作者为华中科技大学/海南大学付玲教授和海南大学骆清铭院士。博士生杨柳、硕士生周一夫、硕士生侯振轩、杨杰副研究员、祁淑红副研究员、刘征教授、张智红教授和刘谦教授为共同作者。
文章链接：
https://www.nature.com/articles/s41467-024-53697-1
