2020年2月28日，《自然·通讯》在线发表了华中科技大学武汉光电国家研究中心张智红教授课题组的最新研究成果“蜂毒肽-脂质纳米颗粒靶向淋巴结并引发系统性抗肿瘤免疫反应”（Melittin-lipid nanoparticles target to lymph nodes and elicit a systemic anti-tumor immune response, Nature Communications, 11, 1110, 2020. DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-020-14906-9）。该论文被Nature Communications编辑选为当月Therapeutics专题的亮点研究予以推荐。
蜂毒肽（melittin）是一种极具抗癌潜力的细胞毒性多肽，通过与肿瘤细胞膜结合，破坏其稳定性，可诱导全肿瘤细胞抗原的释放。作为一种宿主防御性多肽，蜂毒肽同时也具有多种多样的免疫调节效应，但是静脉给药时具有极强的溶血副作用，而皮下注射时由于其极低的分子量（2840 Da）易入血并被肾脏快速清除，难以聚集到免疫器官（如淋巴结）内发挥其免疫调节作用。张智红教授课题组前期已经成功地将melittin装载到仿高密度脂蛋白（HDL）的多肽-脂质纳米载体上，获得超小粒径（~20 nm）的蜂毒脂质纳米颗粒（α-melittin-NP），有效地解决了其在体内运输中存在的毒副作用，为研究α-melittin-NP的免疫刺激效应及抗肿瘤作用奠定了基础。为了进一步探索α-melittin-NP在肿瘤疫苗方面的应用，张智红教授带领博士生余祥和戴艳锋等人，经过四年不断摸索研究，最终发展了一种可诱导全肿瘤细胞抗原释放的淋巴结靶向纳米疫苗。α-melittin-NP经瘤内注射后，通过“一石二鸟”机制，既作用于肿瘤细胞以释放全抗原，又靶向淋巴结以激活抗原提呈细胞（APC），从而诱导机体产生系统性的抗肿瘤免疫反应，成功地抑制肿瘤生长甚至清除肿瘤（图1）。
图1：α-melittin-NP诱导的系统性抗肿瘤免疫反应机制示意图
为了验证α-melittin-NP诱导全肿瘤细胞抗原释放的能力，作者借助于实时动态成像的方法，在体外对肿瘤细胞mAmetrine-B16F10进行了长时程动态成像。结果显示α-melittin-NP处理后，mAmetrine-B16F10的荧光蛋白信号快速减弱乃至消失，同时碘化丙啶（PI）阳性信号出现（图2a）。瘤内注射α-melittin-NP后，肿瘤组织切片的荧光成像结果显示，α-melittin-NP能够诱导模式抗原tfRFP原位释放，进一步证实了α-melittin-NP具有在体诱导肿瘤细胞死亡进而释放细胞内抗原的能力（图2b）。在验证了α-melittin-NP对肿瘤细胞的直接作用之后，接下来研究其对淋巴结的靶向免疫调节作用。宽场成像结果显示，α-melittin-NP尾根部皮下注射后3 h即可引流至腹股沟及腋下淋巴结，而游离melittin难以探测到（图2c）。共聚焦成像及流式实验均证实，α-melittin-NP被巨噬细胞和DC吞噬，并且上调CD80和CD86等共刺激分子表达，激活淋巴结内APC，重塑淋巴微环境（图2d, e）。
图 2：α-melittin-NP诱导全肿瘤细胞抗原释放及APC激活。（a）肿瘤细胞的实时动态成像，青色：mAmetrine-B16F10细胞，红色：碘化丙啶（PI）。（b）肿瘤组织切片的免疫荧光成像，红色：tfRFP-B16F10细胞，绿色：TUNEL。（c）宽场成像观察α-melittin-NP的淋巴结靶向性，ILN：腹股沟淋巴结，ALN：腋下淋巴结。（d）淋巴结切片的免疫荧光成像，蓝色：巨噬细胞，洋红：树突状细胞，绿色：FITC标记的纳米颗粒或melittin。（e）流式检测淋巴结APC活化。比例尺：10 μm。
在确证了α-melittin-NP具有释放全肿瘤细胞抗原和重塑淋巴微环境的能力之后，作者在C57BL/6小鼠上建立双侧黑色素瘤模型，在体验证其肿瘤疫苗效果。如图3a所示，左侧肿瘤作为肿瘤抗原池，右侧肿瘤用来观察疫苗诱导的系统性抗肿瘤效应。结果表明，左侧瘤内注射α-melittin-NP可以导致92%的右侧（远位）肿瘤生长抑制，其中50%肿瘤完全消退（图 3b,c）。免疫学机制研究结果显示，瘤内注射α-melittin-NP，可诱导引流淋巴结内的肿瘤特异性IFN-γ+ CD8+T细胞比率明显升高，是PBS组的12.2倍和melittin组的3.3倍（图 3d）；可诱导远位肿瘤内的趋化因子CCL3-4、CXCL10、CCL22、CXCL5和炎症因子TNF-α、IL-β、IL-1α、IL-6上调，以及大量的CD4+ T和CD8+ T细胞浸润（图 3e）。
该研究所发展的瘤内注射α-melittin-NP产生淋巴结靶向肿瘤疫苗的新策略，打破了肿瘤疫苗需要使用肿瘤相关抗原或者新生抗原的限制，且无需免疫佐剂，还具有制备与操作简单、生物相容性好、安全有效和不受个体限制等诸多优点，具有很好的临床应用前景。研究工作得到了国家杰出青年科学基金（81625012）、国家自然科学基金委员会创新研究群体科学基金（61721092）和中央高校基本科研业务费专项资金（2019kfyXMBZ022）等项目的资助。张智红教授为论文通讯作者，博士研究生余祥和戴艳锋为共同第一作者，骆清铭院士、祁淑红博后和博士生赵一帆、刘磊、卢利森作为共同作者参与相关工作。
全文链接： https://www.nature.com/articles/s41467-020-14906-9
图 3：α-melittin-NP诱导的肿瘤疫苗效应及机制。（a）治疗方案。（b）远位肿瘤生长曲线。（c）远位肿瘤无瘤比例。（d）全肿瘤细胞抗原特异性的细胞免疫应答。（e）远位肿瘤的免疫细胞浸润，红色：tfRFP-B16F10细胞，蓝色：CD4+ T 细胞，绿色：CD8+ T 细胞，比例尺：20 μm。
