2020年3月19日，Biomaterials在线发表了华中科技大学武汉光电国家研究中心张智红教授课题组的最新研究成果“姜黄素纳米颗粒靶向免疫调节炎症性单核细胞过血脑屏障，延缓实验性自身免疫性脑脊髓炎进程”（Targeted Immunomodulation of Inflammatory Monocytes across the Blood-Brain Barrier by Curcumin-loaded Nanoparticles Delays the Progression of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis [J]. Biomaterials, 245:119987, 2020）。
多发性硬化症（MS）是一种由免疫系统攻击中枢神经系统（CNS）产生的自身免疫性疾病，可导致感觉、运动和认知功能丧失。MS发病期间，大量外周血免疫细胞浸润中枢神经系统，导致小胶质细胞活化、脱髓鞘和轴突损伤。临床上针对这类疾病的治疗用药主要靶标是T细胞和B细胞，但由于血脑屏障（BBB）的存在，药物脱靶效应以及副作用等原因，导致临床用药效果欠佳。基于已知抗原的免疫耐受方法，在MS的动物模型“实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）”中治疗效果显著，但由于产生MS抗原的表位扩展效应，无法有效应用于临床治疗MS。单核细胞是由骨髓发育而来的一类主要存在于外周血中的吞噬类免疫细胞，在清除病原体和起始炎症中发挥关键作用。MS和EAE模型早期，大量单核细胞浸润是共同的特征。在EAE模型中，通过剔除单核细胞能够显著抑制疾病进程，但由于现有剔除单核细胞方法存在脱靶效应，以及用药剂量大且需要反复注射给药等问题，难以有效地转化为临床应用。
图1纳米颗粒Cur-HPPS(DiR-BOA)靶向调节炎症单核细胞的示意图
为了靶向免疫调控单核细胞以实现对EAE模型的治疗，张智红教授课题组基于前期发展的仿高密度脂蛋白纳米颗粒HPPS，发展了可携带疏水药物姜黄素（curcumin）的纳米药物Cur-HPPS，并在其疏水核心装载近红外成像染料DiR-BOA。研究发现，HPPS(DiR-BOA)可被外周血单核细胞高效特异性地摄取，由于单核细胞在EAE早期会大量浸润到CNS内，因此聚集于脑和脊髓的HPPS(DiR-BOA)信号可作为EAE的早期指征（图1a）；而装载有姜黄素的Cur- HPPS(DiR-BOA)可明显抑制单核细胞过BBB，有效延缓EAE病程（图1b）。
为了证实HPPS能够在体靶向外周血炎性单核细胞并作为EAE早期的指征，该研究在MOG35-55肽免疫小鼠制备EAE模型的第13天尾静脉注射HPPS(DiR-BOA)，并于24小时之后进行整体荧光成像（图2a）。成像结果显示，HPPS(DiR-BOA)募集于发病小鼠的脑和脊髓部位，而在正常小鼠的CNS区域无信号（图2b和c）。流式检测结果证实，小鼠外周血中90%以上单核细胞摄取HPPS(DiR-BOA)，而其它免疫细胞（如中性粒细胞）的摄取率不到5%（图2d），且单核细胞摄取HPPS(DiR-BOA)的量远高于中性粒细胞（图2e）。为了确证进入CNS的HPPS(DiR-BOA)是经由单核细胞携带过BBB的，流式分析CNS中细胞摄取HPPS(DiR-BOA)的情况。结果表明，小胶质细胞和其它非免疫细胞不摄取纳米颗粒（图2f）；而组织切片荧光成像显示，浸润到CNS中的单核细胞与DiR-BOA荧光高度共定位（图2g）。由此可见，EAE模型中，纳米颗粒HPPS(DiR-BOA)经由炎症单核细胞摄取而被带入到CNS，成像检测CNS的HPPS(DiR-BOA)信号可作为EAE发生的指征。
图2评价HPPS(DiR-BOA)对外周和CNS炎性单核细胞的靶向能力。（a）EAE模型制备与纳米颗粒注射和荧光成像实验步骤示意图。（b）体内DiR-BOA信号荧光成像图。黄色箭头表示大脑和脊髓，红色圆圈为MOG35-55肽免疫区域。（c）体外DiR-BOA信号荧光成像图。（d和e）HPPS(DiR-BOA)注射后6h和24 h，单核细胞和中性粒细胞中DiR-BOA+细胞的百分比(d)和DiR-BOA平均荧光强度(e)。（f）HPPS(DiR-BOA)注射后24h，CNS中不同细胞的DiR-BOA荧光强度直方图。（g）HPPS(DiR-BOA)注射后24h，EAE小鼠和正常小鼠脊髓冰冻切片图像。黄色方框表示放大的区域，蓝色为DAPI信号，绿色为CX3CR1信号，红色为DiR-BOA信号。大图标尺为500 μm，小图标尺为50 μm。
为了证明Cur-HPPS对EAE模型的治疗作用（治疗流程如图3a），EAE模型建立的第8、10、12和14天分别尾静脉注射Cur-HPPS（姜黄素剂量为1.8mg/kg）。EAE模型临床评分结果显示，Cur-HPPS能够有效延缓EAE的病程，EAE发病小鼠的临床发病分数控制在1以下（图3b），且小鼠维持正常体重（图3c）。尤为重要的是，EAE诱导后第19天，Cur-HPPS治疗组小鼠的EAE发生率仅为30%（图3d）。由此证明，装载姜黄素纳米颗粒Cur-HPPS在延缓EAE进程上具有显著效果。为了探究Cur-HPPS的作用机制，通过对不同治疗组的CNS内免疫细胞进行流式分析，证实Cur-HPPS通过抑制外周血炎性单核细胞进入EAE小鼠CNS，从而限制了CNS内TH1和TH17细胞的浸入和小胶质细胞的增殖，减弱了CNS的免疫炎症性损伤。免疫荧光检测进一步揭示了Cur-HPPS阻止炎性单核细胞过BBB的分子机制，是通过抑制细胞内NF-κB活性，致使粘附分子和跨内皮迁移相关分子（如ICAM-1和Mac-1）的表达下调，从而抑制了单核细胞跨越BBB的能力。
图3评价Cur-HPPS对EAE进程的抑制作用。（a）Cur-HPPS治疗流程示意图。（b，c）PBS、姜黄素、HPPS或Cur-HPPS处理的EAE模型小鼠临床评分（b）和体重（c），OVA免疫小鼠作为阴性对照。（d）EAE诱导后第19天各组小鼠的EAE发生率。
综上所述，纳米颗粒HPPS携载姜黄素特异性靶向和免疫调控外周血炎性单核细胞，成功地降低了小鼠EAE的发病率和发病程度，为临床多发性硬化症的治疗提供了新方法，同时也为基于单核细胞的CNS药物输送提供了便捷的新途径。研究工作得到了国家杰出青年科学基金（81625012）和国家基金委创新研究群体科学基金（61721092）等项目的资助。张智红教授为论文通讯作者，博士研究生卢利森和博士后祁淑红为共同第一作者，硕士研究生陈宇宙、博士研究生黄松林、余祥博士、骆海明教授和骆清铭院士为共同作者参与相关工作。
全文链接：https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2020.119987
