2020年9月，《Light: Science & Applications》在线发表了华中科技大学武汉光电国家研究中心张智红教授和骆清铭院士课题组的最新研究成果“Metastatic Status of Sentinel Lymph Nodes in Breast Cancer Determined with Photoacoustic Microscopy via Dual-Targeting Nanoparticles”。研究团队开发了一种双靶向乳腺癌细胞的透明质酸纳米探针5K-HA-HPPS，其核心装载近红外荧光染料DiR-BOA后可用于对乳腺癌前哨淋巴结的活体荧光/光声成像检测，能够准确地鉴别肿瘤转移淋巴结与炎症性淋巴结。
准确鉴定肿瘤前哨淋巴结的转移状态，对于乳腺癌病人的分期以及选择合适的治疗方案具有重要的指导意义。在肿瘤细胞浸润和炎症刺激条件下，淋巴结都会发生肿大，因此我们需要在乳腺癌手术过程中准确鉴定前哨淋巴结的状态，辨别肿瘤转移的前哨淋巴结、炎症性淋巴结和正常淋巴结，从而减少因不必要的淋巴结切除而导致的副作用发生。
为了预测前哨淋巴结是否发生转移，研究者已经开发了多种基于被动靶向淋巴结中巨噬细胞的纳米探针。在炎症刺激条件下，淋巴结中的巨噬细胞会大量增殖，导致炎症性淋巴结中的信号增强；而当淋巴结中发生肿瘤转移时，淋巴结中的巨噬细胞相对数量较少，故呈现较弱信号。由此，基于淋巴结内信号的强弱来区分T-MLN和Inf-LN的方法，不足之处在于：信号强弱是相对值，有时很难界定；二是当淋巴结完全被肿瘤细胞占据时，难以检测到前哨淋巴结的信号，以至于无法确定前哨淋巴结的位置。Li Tang和Geoffrey P. Luke等人开发了靶向肿瘤细胞高表达分子（nucleolin和EGFR）的纳米探针，可有效地鉴别肿瘤转移的前哨淋巴结（T-MLN）和正常淋巴结（N-LN），但不能区分炎症性淋巴结（Inf-LN）。迄今为止，如何准确地区分T-MLN和Inf-LN，仍是困扰临床医生和影像学研究者们的难题。
透明质酸（HA）是一种线性粘多糖，是所有活生物体细胞外基质的重要组成部分。HA也是CD44蛋白的配体，CD44蛋白在多种肿瘤细胞表面过表达，HA可作为设计乳腺癌靶向分子探针的候选者。然而，HA与CD44结合后，细胞内化CD44的效率降低，从而HA与CD44的结合容易达到饱和；另外，CD44糖基化可负调节其识别HA的能力并抑制CD44介导的摄取效率。因此，仅通过HA介导的肿瘤细胞靶向，不足以获取高信噪比的成像效果。
本课题组前期发展了一种高效靶向清道夫受体B1（SR-B1）的仿高密度脂蛋白纳米载体HPPS。乳腺癌细胞高表达CD44和SR-B1，研制针对这两种分子的双重靶向纳米载体，将有助于提升淋巴结内乳腺癌细胞的靶向标记和特异性识别能力。本研究以仿高密度脂蛋白纳米颗粒HPPS为载体，其表面偶联HA分子，核心装载近红外荧光/光声双模式成像造影剂DiR-BOA，研制的纳米颗粒5K-HA-HPPS具有快速进入前哨淋巴结并靶向标记乳腺癌细胞的能力。通过荧光成像可以长时程动态监测5K-HA-HPPS在淋巴结中的蓄积情况，而光声成像则可以显示纳米颗粒在完整淋巴结中的空间分布信息。
5K-HA-HPPS是由生物相容性极好的磷脂、多肽、胆固醇、HA等物质组成的粒径约40 nm的球形纳米颗粒（图1）。使用4T1乳腺癌细胞体外验证5K-HA-HPPS的靶向性，激光共聚焦成像和流式细胞检测结果表明，与单一靶向的纳米颗粒HPPS和5K-HA-e相比，4T1细胞摄取5K-HA-HPPS的能力明显增强（图2A）。重要的是，5K-HA-HPPS不仅在体外能够高效靶向乳腺癌细胞，在活体内也具有高效靶向标记淋巴结内转移乳腺癌细胞的能力（图2B、2C）。淋巴结组织切片的荧光成像结果显示，5K-HA-HPPS的DiR-BOA荧光信号与4T1细胞的荧光蛋白tfRFP信号的共定位比例高，而HPPS的信号较少与4T1细胞共定位（图2C）。
图1 双靶向纳米颗粒5K-HA-HPPS的成份和结构示意图。
图2体外和在体验证纳米颗粒靶向乳腺癌细胞的能力。
活体荧光成像动态监测纳米颗粒在淋巴结中的蓄积，结果如图3所示，双靶向纳米颗粒5K-HA-HPPS能够快速（皮下注射10 min以内）有效地标记腿弯淋巴结。纳米颗粒5K-HA-HPPS注射6 h后, 其荧光信号强度分别是对照组HPPS和5K-HA-e的3.0倍和2.3倍。并且5K-HA-HPPS在淋巴结中的驻留时间至少长达12 h。
图3 活体荧光成像动态监测纳米颗粒在淋巴结中的蓄积。
本文中使用的荧光成像是二维成像，虽然可以监测纳米颗粒在淋巴结的蓄积，但由于5K-HA-HPPS的荧光信号在T-MLN和Inf-LN中均显著增强，因此仅通过荧光成像是难以区分T-MLN和Inf-LN的。体外流式检测结果表明，4T1细胞摄取5K-HA-HPPS的能力明显强于巨噬细胞。Inf-LN中增殖的巨噬细胞主要位于淋巴结外周，而T-MLN中转移并增殖的肿瘤细胞主要位于淋巴结中间区域，并且随着时间的推移淋巴结外周的肿瘤细胞也会迁移至淋巴结的中间区域。基于此特点，我们应用光声成像的高空间分辨和深度组织成像的特点，获取活体淋巴结内纳米颗粒5K-HA-HPPS的空间分布信息，以达到区分T-MLN和Inf-LN的目的。图4A展示的是小鼠淋巴结活体光声显微成像最大强度投影图，5K-HA-HPPS 在T-MLN中的光声信号分布，与其在Inf-LN和N-LN相比，呈现出明显不同的特征。5K-HA-HPPS的光声信号主要分布在T-MLN的内部，与之相反，在Inf-LN和N-LN主要分布于外周。为了量化描述淋巴结内光声信号的分布特征，我们对淋巴结的直径进行归一化处理，计算淋巴结内部区域与周围区域的光声信号强度比值（R）。结果如图4B所示，T-MLN的光声信号R值是Inf-LN的30.4倍，是N-LN的13.2倍。淋巴结组织切片的荧光成像结果也验证了纳米颗粒在不同状态淋巴结内的分布特征（图4C），进一步证实活体光声成像结果的可靠性。综上所述，本研究利用基于声学分辨率光声显微成像的高空间分辨和深度组织成像能力，获取淋巴结内纳米颗粒5K-HA-HPPS的空间分布信息，实现了肿瘤转移的淋巴结、炎症性淋巴结和正常淋巴结的鉴别判定。
图4 活体光声成像显示不同状态淋巴结内5K-HA-HPPS的光声信号分布及定量比较。
本研究通过将光声显微成像的空间分布检测能力与纳米颗粒的乳腺癌细胞双靶向能力相结合，建立乳腺癌转移前哨淋巴结鉴定新方法，有效地解决了肿瘤转移的前哨淋巴结与炎症性淋巴结难以区分的难题，有望为乳腺癌手术过程中快速鉴定前哨淋巴结是否发生了肿瘤转移提供在体检测手段，具有重要的临床应用价值。
研究工作得到了国家杰出青年科学基金（81625012）、国家自然科学基金委员会创新研究群体科学基金（61721092）和中央高校基本科研业务费专项资金（2019kfyXMBZ022）等项目的资助。华中科技大学武汉光电国家研究中心的博士生戴艳锋、余祥和魏剑霜为文章共同第一作者，张智红教授和骆清铭院士为文章的共同通讯作者。
全文链接：https://www.nature.com/articles/s41377-020-00399-0
