近日，华中科技大学武汉光电国家研究中心张智红教授团队，应用活体显微光学分子成像方法，动态监测细胞毒性T细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）杀伤肿瘤细胞过程，可视化研究免疫细胞的运动行为和肿瘤细胞关键分子事件的时空特性。进而，建立活体定量评价CTL杀伤肿瘤细胞能力的方法，揭示肝脏中CTL杀伤肿瘤效率受限的分子机制，是与肝脏组织中高表达免疫抑制因子IL-10有关。研究成果以“Intravital molecular imaging reveals the restrained capacity of CTLs in the killing of tumor cells in the liver”为题发表在Theranostics, 11(1): 194-208, 2021。
CTL是适应性免疫反应中清除肿瘤的主要效应细胞，基于CTL及基因工程改造T细胞的过继细胞回输疗法（adoptive cell therapy，ACT）在黑色素瘤和白血病等肿瘤的治疗上获得了积极的疗效。然而，ACT的疗效在不同个体之间差异很大。虽然CTL在体外杀伤肿瘤的效率非常高，但其被过继回输到体内后受到体内复杂微环境的影响，在肿瘤区域内的杀伤效率通常远低于体外。这就需要建立一种可以在体定量CTL杀伤肿瘤细胞能力的方法，用于评价体内环境因素对CTL杀伤效率的影响，从而有利于发掘提升ACT疗效的策略。
图 1. 文章概要图。
研究人员筛选得到稳定表达遗传编码型分子探针的黑色素瘤细胞株，可用于光学表征肿瘤细胞凋亡（caspase-3探针C3）和钙信号（钙探针Twitch2B）的动态变化。tdTomato荧光蛋白标记的OT-I CTL（tdTomato-OT-I CTL）在体外激活后，过继回输到荷瘤鼠体内，以建立多色标记的CTL杀伤肿瘤可视化模型。进而，应用活体显微光学分子成像方法，动态监测CTL特异性识别与杀伤肿瘤的过程及相关分子事件变化。活体动态成像结果显示，在B16-C3-OVA组中多个CTL围攻一个肿瘤细胞可长达一个多小时，并且肿瘤细胞C3探针的荧光共振能量转移（FRET）信号逐渐丢失，表明在此过程中肿瘤细胞从活细胞（红色-FRET）变为凋亡细胞（绿色-CFP）（图2A）。在肿瘤细胞发生凋亡的过程中，FRET与CFP荧光信号的比值（FRET/CFP）逐渐降低（图2B）。FRET信号丢失所需的时长是多样的，从几分钟到一个小时，大部分细胞需要20分钟左右（图2C）。如图2D显示，存活的肿瘤细胞FRET/CFP比值一直维持比较高的水平，而已凋亡的肿瘤细胞FRET/CFP比值一直处于很低的水平。
图 2. 活体成像监测CTL诱导的肿瘤细胞caspase-3活化。（A）动态成像监测CTL与肿瘤细胞长时间接触并导致肿瘤细胞FRET信号丢失的过程。（B）发生凋亡的肿瘤细胞FRET信号随时间变化曲线。（C）发生凋亡的肿瘤细胞FRET/CFP值从开始降低到最小值所用时间的统计图。（D）存活细胞和凋亡细胞的FRET/CFP值随时间变化曲线。
进一步对成像过程中CTL与肿瘤细胞的接触时长进行统计，结果显示B16-C3-OVA组中平均每个CTL与肿瘤细胞接触时间为49.4 ± 3.7 min，远长于B16-C3组中的3.9 ± 1.1 min（图3A）；B16-C3-OVA组中CTL与肿瘤细胞发生稳定接触的比例为73.75%，远高于B16-C3组的13.6%（图3B）。动态成像数据的定量分析显示，活体内诱导肿瘤细胞凋亡所需的CTL累计接触时间是98.9 ± 6.3 min（图3C），在凋亡的肿瘤细胞中，16.5%的细胞是仅与1个CTL发生接触，而高达82.6%的细胞是与多个CTL发生过接触，其中68.6%的细胞与2-3个CTL发生接触，14.0%的细胞与4-6个CTL发生接触（图3D）。图3E展示了一个典型的例子，6个CTL先后与一个肿瘤细胞接触并导致肿瘤细胞发生凋亡。这些结果表明，CTL通过长时间稳定接触表达同源抗原的肿瘤细胞，以杀伤肿瘤细胞诱导其凋亡，此过程是多个CTL协同作用的结果。
图 3. 活体动态显微成像证实肝脏中肿瘤细胞的凋亡是多个CTL协同作用的结果。（A）每个CTL与肿瘤细胞接触时间，*** P < 0.001。（B）与肝转移肿瘤细胞发生接触的CTL的比例，*** P < 0.001。（C）每个发生凋亡的肿瘤细胞与CTL累计接触时间，这个值代表诱导一个肿瘤细胞从存活到凋亡所需要的CTL接触时间。（D）每个发生凋亡的肿瘤细胞在凋亡前与其接触的CTL细胞个数占比。（E）六个CTL（用洋红、绿色、青色、黄色、红色、灰色小球标注）与同一个肿瘤细胞先后接触导致肿瘤细胞发生凋亡，标尺：5 μm。
图 4. 活体动态分子成像比较肝脏和脾脏中CTL杀伤肿瘤细胞的能力。（A）活体成像揭示肝脏和脾脏中CTL杀伤肿瘤细胞的动态过程。标尺：10 μm。（B）在肝脏和脾脏中每个发生凋亡的肿瘤细胞所需的CTL累计接触时间，*** P < 0.001。（C）肝脏和脾脏中CTL杀伤肿瘤细胞的效率。一个点代表一段时长2 h左右的视频，每组数据来自7-9只小鼠，*** P < 0.001。（D）肿瘤内浸润CTL数目和每个小时肿瘤细胞发生凋亡个数进行相关性分析。一个点代表一段时长2 h左右的视频。
为了比较肝脏和脾脏中CTL杀伤肿瘤细胞的效率，该研究构建了肝脏和脾脏原位肿瘤模型。将5 × 105个B16-C3-OVA肿瘤细胞接种到小鼠肝脏和脾脏浅表位置，在肿瘤接种三天后过继回输体外激活的OT-I CTL。在CTL回输后24小时对肝脏和脾脏进行活体光学成像，动态监测CTL杀伤肿瘤细胞的过程（图4A）。定量分析结果表明，肝脏中肿瘤细胞发生凋亡前的CTL累计接触时间（123.3 ± 11.7 min）显著长于脾脏中所需的时间（83.0 ± 7.1 min）。由此可见，在肝脏中CTL需要与肿瘤细胞作用更长时间才能诱导肿瘤细胞发生凋亡（图4B）。引入公式(Ndeath / NCTLs) × 24 / timaging 来量化CTL每天杀伤肿瘤细胞的能力，其中Ndeath代表活体成像过程中每个视野内发生凋亡的肿瘤细胞个数，NCTLs代表成像过程中CTL的平均数目，t timaging代表成像的小时数。定量计算结果显示，肝脏中每个CTL每天仅能杀伤1.24 ± 0.11个肿瘤细胞，与脾脏相比（3.18 ± 0.26）非常低效（图4C）。对肿瘤内CTL数目和每小时肿瘤细胞发生凋亡个数进行相关性分析后发现，在肿瘤微环境内有相同CTL数目的情况下，脾脏中的CTL每小时能够杀伤更多的肿瘤细胞（图4D）。这些结果表明，与肝脏相比，脾脏中的CTL具有更高的肿瘤细胞杀伤能力。进一步研究发现，造成肝脏中CTL杀伤能力受限的可能原因之一，是肝脏内高表达抑制性细胞因子IL-10。当使用IL-10抗体阻断IL-10的功能后，肝脏中CTL杀伤肿瘤细胞的效率明显提高。
该研究对CTL诱导的肿瘤细胞早期应答分子事件也进行了在体监测。他们利用一种可以在体表征肿瘤细胞钙信号的荧光蛋白探针，活体动态成像监测CTL诱导的肿瘤细胞内钙信号变化。不同于肝脏中肿瘤细胞自发的短时间（< 30 s）钙信号升高，CTL杀伤会导致肿瘤细胞发生持续性（> 30 s）钙信号升高。肿瘤细胞发生持续钙信号升高的时间，早于caspase-3活化的时间约40 min，提示持续性钙信号升高是肿瘤细胞凋亡的前期步骤。
综上所述，该研究应用活体光学成像技术动态监测肿瘤免疫相关的分子和细胞事件，建立了一种可以在体定量CTL杀伤肿瘤细胞能力的方法，并证明在肝脏免疫耐受环境中CTL杀伤肿瘤细胞的能力是受限的，从而为在体评估肿瘤免疫治疗的有效性以及理解器官免疫状态对细胞免疫治疗的影响提供了准确信息。
该研究得到国家杰出青年科学基金（81625012）、国家自然科学基金（91842305，61721092）、华中科技大学学术前沿青年团队项目和武汉光电国家研究中心创新基金的资助。华中科技大学武汉光电国家研究中心张智红教授为文章的通讯作者，课题组成员博士研究生刘磊为文章的第一作者，博士研究生代博雷、硕士研究生李瑞雪、博士后刘征为共同作者参与了相关工作。
参考文献：
Lei Liu, Bolei Dai, Ruixue Li, Zheng Liu, and Zhihong Zhang. Intravital molecular imaging reveals the restrained capacity of CTLs in the killing of tumor cells in the liver. Theranostics, 11(1): 194-208, 2021.
原文链接：https://www.thno.org/v11p0194.htm
