2022年7月20日，华中科技大学武汉光电国家研究中心骆清铭/袁菁团队在Cell Press细胞出版社旗下交叉学科期刊iScience上发表了题为“Cryo-fluorescence micro-optical sectioning tomography for volumetric imaging of various whole organs with subcellular resolution”的研究论文。该团队发展了一种低温荧光显微光学切片断层成像（cryo-fMOST）技术，以亚微米体素分辨率分别对正常小鼠的舌头、肾脏和脑以及心梗疾病模型鼠的心脏等完整器官进行了三维成像与重建，高保真地获取了精细解剖结构。并进一步对收集到的已成像冰冻脑片做了磷酸糖测定和荧光原位成像（FISH），初步展示了cryo-fMOST与多组学测量的兼容性，表明该技术有望用于空间多组学的研究。
相关背景
在亚微米分辨率下高保真地三维可视化各种器官的精细结构，并有效保留细胞的生化信息内涵，对于理解器官功能、攻克相关疾病具有重要意义。然而，现有的高分辨率全器官三维光学成像技术的组织处理均在不同程度引入难以忽略的组织形变，而冰冻包埋能同时兼顾组织原有形态及生化信息的保持，但尚缺乏与之配套的低温高分辨率大体积三维成像技术。本研究提出和发展了一种全新的cryo-fMOST技术，以解决上述难题。
结果解读
1. 完整器官三维低温显微成像流程
该团队使用OCT包埋完整器官并迅速冷冻，以尽可能保持器官内精细结构的原有形态；利用自主研发的cryo-fMOST技术对完整器官以亚微米体素分辨率进行三维成像，每次对冰冻样本表面进行成像，然后切除已成像部分以暴露新的待成像表面，成像与切削交替重复，直至获取完整器官数据集；随后进行数据处理、特征分割和三维可视化等操作。其中，采用基于热电级联冷却的制冷方式，自主设计并构建了稳定、无振动的低温成像环境，为实现低温高分辨率三维显微成像提供了技术支撑。
图1. cryo-fMOST流程及系统
2. 获取完整小鼠舌头肌纤维的空间排布
为了评估cryo-fMOST应用于致密肌性器官成像的可行性，该研究对B6 ACTb-EGFP小鼠舌头进行了三维成像及重建，并对典型图像进行了张量分析以注释肌肉纤维的方向。研究结果展示了cryo-fMOST技术获取不同类型肌纤维空间排布的能力，将有助于理解舌头执行吞咽、发音等功能的机理。此外，周期约2 μm的肌小节等精细结构被清晰观测，证明了cryo-fMOST不受肌纤维走向的影响，可实现高质量的组织切削与显微成像（图2）。
图2. 完整小鼠舌三维成像及重建的结果
3.完整肾脏精细结构成像
为了评估cryo-fMOST对富含水分实质器官的成像能力，该团队以0.32×0.32×3 μm3的体素分辨率对mT/mG小鼠肾脏进行了成像采集。根据荧光信号强度和显微结构差异，划分出解剖区域，并在相应的解剖区域观测到典型的显微解剖特征。微米尺度的成像分辨率使得cryo-fMOST图像质量可以支持自动识别肾脏基本功能单元肾小球（GT），文章定量统计了全肾脏的肾小球数量为14,489个，与已报道文献相符（图3）。未来结合疾病模型，将有可能更系统、客观地定位并分析全肾脏范围肾小球的形态变化，有助于理解肾功能、促进肾病学的发展。
图3. 完整小鼠肾脏三维成像及重建结果
4. 可视化心梗疾病模型鼠完整心脏的精细解剖结构及再生血管
为证明cryo-fMOST对空腔器官的形态保持与成像能力，该团队与第三军医大学王伟教授/万瑛教授团队合作，以0.32×0.32×3 μm3的体素分辨率分别对正常和心梗血管结扎五周的mT/mG小鼠全心脏进行了成像、可视化及对比研究。结果表明，心室等腔室较好地保持了原始结构，心肌桥、血管壁等精细结构可以清晰分辨，血管网络的分级结构可以准确地追踪与重建。特别的，与正常心脏对比，在心梗心脏中观察到长度为0.51 mm的结扎动脉完全梗死，并发现一根连接结扎动脉和相邻动脉的侧支动脉（CA），而在传统二维组织切片中难以准确观察并识别出这类血管。心肌细胞在心肌梗死区域的荧光强度明显低于其他区域，而CA附近心肌细胞的荧光强度并没有恢复，提示CA的建立可能只能恢复血管运输，而不能逆转受损的心肌细胞（图4）。
图4. 健康及心梗小鼠完整心脏三维成像及重建结果
5. 完整鼠脑特定类型神经元分布成像
为了测试cryo-fMOST对软组织的成像能力，该团队对Thy1-GFP小鼠右脑进行了三维成像。与基于树脂包埋的三维成像相比，该结果中脑室无明显形变。对比线共聚焦和数字结构光调制（DSM）模式的成像效果，后者具有更好的背景抑制效果，神经元胞体和纤维更锐利、清晰。这些结果表明，cryo-fMOST适用于对组成复杂的器官进行可视化，为感兴趣区域提供可灵活调节的光学层析能力（图5）。
图5. 完整小鼠脑的三维成像结果
6. cryo-fMOST与磷酸糖及mRNA测量相容
冰冻样本处理与成像为cryo-fMOST与后续生化分析联动提供了可能。磷酸糖作为生物能量代谢和碳代谢的中间体，在生物体内发挥着重要作用。为了验证cryo-fMOST与代谢组学的相容性，该团队收集了cryo-fMOST成像后的海马脑片，与武汉大学冯钰锜教授团队合作，结合同位素化学标记和反相液相色谱-质谱测量进行了9种糖磷酸测定。结果表明，经过cryo-fMOST数小时成像后所收集到的脑片，均能检测到与新鲜冰冻切片含量相当的磷酸糖，而经光透明处理后的脑片基本无法检出磷酸糖。这展示了cryo-fMOST相比光透明技术无法检测小分子这一不足有明显优势，具有与代谢组学等小分子检测结合的应用潜力（图6）。
图6. 冰冻切削脑片及光透明脑片代谢中间分子磷酸糖含量测量对比
该团队进一步对同一个鼠脑经cryo-fMOST成像后收集到的脑片进行了FISH成像，获取camkII2α表达基因的空间分布。该结果表明，收集到的已成像脑片能保持mRNA的信息以支持FISH成像，初步展示了cryo-fMOST技术与FISH等转录组学检测的兼容性与应用潜力。
图7. 对经cryo-fMOST成像后收集到的冰冻切削脑片开展荧光原位杂交染色成像的结果
总结
本研究建立了基于冰冻切片的cryo-fMOST新技术，能可视化并重建完整器官的精细解剖结构并保持其生化信息，对不同类型生物组织均具有良好的适应性。该技术有望用于研究特定器官中不同类型细胞、血管等基本单元之间的排布规律与相互关系，未来有望与组学测量联动，促进对相关器官功能机理的理解，助力探索相关疾病的发病机制。
