2023年5月2日，《Nano Today》在线发表了张智红教授团队的最新研究成果“In Situ Phagocyte-mediated Deep Tumor Penetration Assisted by ApoA-1 Mimetic Peptide-modified Silicasome”。研究团队开发了一种可视化的介孔二氧化硅纳米颗粒（MSN），其负载吲哚菁绿（ICG）、外部由脂质包封、表面由apoA-1模拟肽（R4F）修饰，命名为R4F‑ICG@L-MSN。研究结果表明，R4F-ICG@L-MSN具有肿瘤内深度渗透与有效驻留、ICG的高效装载与光热效应提升、以及光热效应诱导的抗肿瘤免疫应答等性能，致使其光声成像能力和光热效应显著提升，由此展现了良好的光声成像引导的肿瘤光热治疗效果。
恶性肿瘤严重危害人类的健康与生命。由于实体瘤表现出显著的异质性、缺氧、供血不足和间质流体压力增加，大多数纳米药物无法充分穿透肿瘤，导致诊断和治疗效果不佳。药物的深度渗透仍然是癌症治疗的一个挑战性问题。一般来说，纳米药物的深度渗透策略分为两类：一类是以尺寸为特征而精心设计的纳米平台，包括CAPIR五步级联递送（血液循环、肿瘤积累、深层渗透、细胞内化和药物释放）与尺寸收缩递送；另一类是细胞介导的药物递送（又称为特洛伊木马策略）。前者通过血管外渗、肿瘤内渗透压的增加、EPR效应等实现肿瘤的深度渗透。后者通过活细胞或人工分离的细胞膜负载纳米颗粒向肿瘤区域的特异性递送，是利用细胞的生理功能，达到优化成像和治疗的效果。但其制备过程仍较为复杂，且肿瘤渗透效果易受肿瘤异质性的影响。因此，开发操作简单且具有深度肿瘤渗透性的纳米药物，将有助于临床转化。
该研究利用清道夫受体（SR-B1）为4T1细胞的生物标志物，以及SR-B1受体在外周血吞噬细胞（单核细胞和中性粒细胞）表达的特性，设计出SR-B1靶向的装载ICG的介孔硅脂质纳米颗粒R4F‑ICG@L-MSN。该纳米颗粒粒径为72 nm（图1a），被包裹的ICG最大吸收峰红移至805 nm（图1b），具有良好的稳定性（图1c）。荧光/光声双模态成像显示R4F-ICG@L-MSNs具有光声“开”和荧光“关”状态（图1d和e）。使用鸡胸肉模拟真实生物条件进行测试，R4F-ICG@L-MSN在0.4 mm和0.7 mm的信号强度分别比游离ICG高1.6倍和2.24倍，尤其是R4F-ICG@L-MSN在1 mm的深度处仍然可以观察到信号，此结果表明R4F-ICG@L-MSN较游离ICG具有更好的组织渗透性（图1f）。纳米颗粒中ICG的浓度或激光功率的增加都能使温度加速上升，在多次激光开关后温度的增幅非常相似（图1g-i），这些结果提示R4F-ICG@L-MSN能够用于体内开展有效的光声（PA）成像引导的光热治疗（PTT）。
图1. R4F‑ICG@L-MSN的特征。（a）DLS与TEM图像。（b）游离ICG与R4F‑ICG@L-MSN的紫外吸收光谱。（c）在不同孵育条件下半变性SDS-PAGE荧光成像图。（d-e）R4F‑ICG@L-MSN与裂解的纳米颗粒（1% Triton X-100处理）的荧光强度图（d）与光声强度图（e）。（f）R4F‑ICG@L-MSN与游离ICG溶液在不同深度鸡胸肉中光声信号比较。（g）在相同激光密度（1.0 W/cm2）下不同ICG浓度的R4F‑ICG@L-MSN光热温度曲线。（h）相同浓度R4F‑ICG@L-MSN （ICG：32 μM）在不同激光功率下的光热温度曲线。（i）R4F-ICG@L-MSN, ICG@L-MSN和ICG@MSN在808 nm激光（1.0 W/cm2）循环开/关照射下温度变化。
为了评估R4F-ICG@L-MSNs在4T1细胞中“开-关”的双模态成像，通过声学分辨率光声显微成像系统和荧光成像系统分别测量时间依赖性PA信号衰减和荧光激活。PA信号在12小时内逐渐增强，从24小时到36小时急剧减弱；而荧光信号在12小时达到峰值，然后经历缓慢衰减（图2a和b）。在无激光照射条件下，R4F-ICG@L-MSNs的细胞毒性可以忽略不计（图2c）。当用808 nm激光照射10分钟后，4T1细胞的存活率显著降低至26%（图2d）。共聚焦图像显示，经R4F修饰的纳米颗粒能够增加4T1细胞对纳米颗粒的摄取（图2e），且流式细胞术定量结果也表明R4F-ICG@L-MSNs被细胞摄取效率高于 ICG@L-MSNs，在RAW264.7细胞内提高了1.8倍，在4T1细胞内提高了1.93倍（图2f）。以上结果表明R4F-ICG@L-MSNs可以被肿瘤细胞和巨噬细胞高效摄取，为后续的靶向杀伤肿瘤细胞奠定了基础。
图2.荧光/光声双模态成像，细胞毒性以及R4F-ICG@L-MSNs的体外SR-B1靶向能力。（a-b）R4F-ICG@L-MSNs在4T1细胞中代谢过程的荧光/光声双模态实时监控图像（a）与数据分析（b）。（c）R4F-ICG@L-MSNs、ICG@L-MSNs和游离ICG对4T1细胞的细胞毒性评估。（d）体外不同纳米颗粒孵育和/或激光照射对肿瘤细胞活性的影响。（e）R4F-ICG@L-MSNs和ICG@L-MSN与4T1细胞共孵育6 h后共聚焦荧光成像（核染色：Hoechst33342）。（f）比较RAW264.7细胞与4T1细胞对R4F-ICG@L-MSNs或ICG@L-MSNs的摄取能力。
受到以上体外实验结果的鼓舞，研究者进一步在活体水平探究apoA-1介导的吞噬类细胞递送R4F-ICG@L-MSN是否可以深度渗透到肿瘤内部。尾静脉注射纳米颗粒48 h后，R4F-ICG@L-MSN组的瘤内积累率明显高于ICG@L-MSN组（图3a）。为了确认外周血中吞噬细胞能将R4F-ICG@L-MSN输送到肿瘤中，静脉注射纳米药物12 h后，采集外周血。由于外周血中单核细胞表达SR-B1受体，与非靶向性纳米颗粒ICG@L-MSN相比， R4F-ICG@L-MSN与单核细胞（Ly6C+标记）的共定位明显（图3b）。同时，采用流式细胞术准确定量R4F-ICG@L-MSN在外周血SR-B1+细胞亚群中的分布情况。结果显示， 绝大多数单核细胞（CD45+CD11b+Ly6C+，91.5%）中可检测到ICG荧光信号，仅少量中性粒细胞（CD45+CD11b+Ly6G+，14.3%）中可检测到，而其他细胞则极少（图3c）。这些数据表明R4F修饰的ICG@L-MSNs在体内通过SR-B1受体被外周血中的吞噬细胞（包括单核细胞和中性粒细胞）有效摄取。肿瘤组织的冰冻切片荧光成像结果显示，在肿瘤内部血管及其附近均能观察到R4F-ICG@L-MSNs（图3d）。综上所述，通过SR-B1介导途径，R4F修饰的ICG@L-MSNs借助外周血吞噬细胞能够被递送到肿瘤病灶，且深度渗透和扩散到整个实体瘤，为PTT等肿瘤治疗策略的优化提供了良好的基础。
图3. 荧光显微成像验证R4F修饰的二氧化硅纳米颗粒的肿瘤渗透与扩散能力。（a）R4F-ICG@L-MSN和ICG@L-MSN静脉注射48 h后的肿瘤组织荧光显微成像图。（b）R4F-ICG@L-MSNs（顶部）和ICG@L-MSNs（底部）静脉注射12 h后，外周血中单核细胞的共聚焦图像。（c）R4F-ICG@L-MSNs静脉注射12 h后，体内原位靶向外周免疫细胞的流式检测。ICG+细胞在不同免疫细胞中的百分比（左图）和ICG+细胞的平均荧光强度（右图）。（d）静脉注射后12小时，R4F@L-FITC-MSN（绿色）在肿瘤内分布的代表性免疫荧光图像。Anti-CD31-AF647（品红色）标记血管内皮细胞。
接下来研究者通过在体荧光/光声双模态成像实时监控，验证了R4F-ICG@L-MSNs在肿瘤中的深度渗透和有效蓄积。尾静脉注射后，通过光声计算机断层扫描（PACT）和荧光成像监测R4F-ICG@L-MSN和ICG@L-MSN在肿瘤内的分布。与由EPR效应递送的ICG@L-MSN相比，通过原位吞噬细胞介导传递的R4F-ICG@L-MSN表现出增强的PA信号和更深的肿瘤渗透能力。在12 h时，R4F-ICG@L-MSNs组的PA信号强度比ICG@L-MSNs组高2.3倍（图4a和c）。同时，在不同时间点对荷瘤小鼠的肿瘤部位进行荧光成像（图4b），R4F-ICG@L-MSNs组肿瘤部位的荧光信号持续增强， 48 h后仍可观察到。收集主要的器官和肿瘤组织进行荧光成像分析，结果显示，注射R4F-ICG@L-MSNs的小鼠瘤内荧光强度是注射ICG@L-MSNs小鼠的6.3倍，且肿瘤与肝脏荧光信号强度比例高4.8倍以上（图4d和e）。以上结果表明R4F修饰的ICG@L-MSNs可以在肿瘤中有效驻留和积累，显著提高了肿瘤靶向递送的效率。
图4.R4F-ICG@L-MSNs的活体双模态成像。（a-b）静脉注射R4F-ICG@L-MSN和ICG@L-MSN后，不同时间点的活体PA成像（a）和荧光成像（b）。（c）纳米颗粒注射后不同时间点的肿瘤PA信号变化定量结果。（d-e）注射R4F-ICG@L-MSNs和ICG@L-MSNs后48小时，主要器官和肿瘤的ICG荧光强度定量结果（e），以及肿瘤与肝脏中的ICG荧光强度比值分析（e）。
考虑到温和的热疗作用可以减少对正常组织和皮肤的损伤，研究者依据图5a所示时间轴，采用多次短时间激光照射4T1皮下瘤小鼠进行光热治疗。在注射NPs后12 h、15 h和18 h，通过同一激光（808 nm，1.0 W/cm2）照射3次，每次照射3分钟。R4F-ICG@L-MSNs在808 nm照射下，肿瘤区域在3分钟内迅速升温至53 ℃，而ICG@L-MSNs组仅在肿瘤区域表现出适当的温度升高，PBS组则显示轻微的温度升高（图5b和c），表明R4F-ICG@L-MSNs具有良好的光热效应。在治疗结束后的第15天，处死小鼠以评估治疗效果（图5d和e）。在单独的R4F-ICG@L-MSNs或激光治疗对照组中，肿瘤几乎不受影响；在ICG@L-MSNs+Laser
3组中，肿瘤生长明显受到但未能消除肿瘤；而在R4F-ICG@L-MSNs+Laser3组，肿瘤完全消退。这些结果表明，R4F-ICG@L-MSNs在肿瘤中的深度渗透和广泛分布特性，增强了光热治疗功效。在整个治疗过程中，小鼠体重没有异常（图5f）。肿瘤组织的TUNEL和H&E分析显示，用R4F-ICG@L-MSNs+Laser3处理相对于其他干预措施，凋亡的肿瘤细胞数量明显增多（图5g和h）。
图5. 在体评价基于R4F-ICG@L-MSNs的光热治疗抗肿瘤效应。（a）多次短时间激光照射的治疗方案示意图。（b-c）静脉注射PBS、ICG@L-MSNs和R4F-ICG@L-MSNs（ICG浓度：258 μM，200 μL）12小时后，激光照射导致肿瘤温度变化的光热成像（b）和定量曲线（c）。（d）不同治疗组第15天的肿瘤图像。（e-f）不同治疗组的肿瘤生长曲线（e）和小鼠体重变化曲线（f）。（g-h）不同治疗组第3天的肿瘤组织TUNEL染色分析。（h）不同治疗组后15天肿瘤组织的H&E染色分析（4×）。
为了揭示R4F-ICG@L-MSN在808 nm照射下的光热治疗效应机制，我们对肿瘤微环境内的免疫细胞类型和细胞因子进行了定量分析。在治疗后的第3天，肿瘤组织免疫荧光成像结果显示，R4F-ICG@L-MSNs+Laser3组中CD206+ 细胞减少和CD8+ T细胞积聚，提示光热治疗后肿瘤组织中M2样肿瘤相关巨噬细胞（TAM）减少和细胞毒性T细胞（CTL）增加（图6a和b）。将肿瘤组织分解成单细胞悬液，通过流式细胞术定量分析免疫细胞的变化，结果显示在ICG@L-MSN+Laser3组的肿瘤中，成熟DC的百分比从9.2%（PBS组）增加到24.1%，而在R4F-ICG@L-MSN+Laser3组成熟DC的比率高达50.4%（图6c）。此外，与PBS组相比，R4F-ICG@L-MSNs+Laser3组肿瘤中 CD8+ T细胞显著增加（与PBS组相比为18.7倍，p＜0.0001）和CD4+ T细胞减少（与PBS组相比为24%，p＜0.001），而在单独的R4F-ICG@L-MSN组或激光治疗组中浸润的T细胞数量变化不明显（图6d和6e）。如图6f和6g所示，R4F-ICG@L-MSN+Laser3组显示促炎细胞因子分泌增加（与PBS组相比，TNF-α为4.8倍，IFN-γ为8.1倍）。这些结果表明R4F-ICG@L-MSN增强的PTT功效不仅可以直接杀死受激光照射的肿瘤细胞，还可以通过提高免疫细胞的浸润和释放促炎细胞因子发挥协同抗肿瘤作用。
图6.基于R4F-ICG@L-MSN的光热效应诱导的抗肿瘤免疫应答。（a-b）用anti-CD206-PE（a）和anti-CD8-AF647（b）染色的肿瘤组织切片的代表性免疫荧光图像。细胞核（蓝色）、M2型巨噬细胞（绿色）和CD8+ T细胞（红色）。（c-e）流式细胞术分析治疗后3天4T1荷瘤小鼠（n＝3）肿瘤中，CD80+CD86+ DC（c）、CD8+ T细胞（d）和CD4+ T细胞（e）的百分比。（f-g）ELISA检测小鼠肿瘤中TNF-α（f）和IFN-γ（g）的含量。
综上所述，该研究设计的apoA-1多肽（R4F）修饰的纳米颗粒（R4F-ICG@L-MSN）具有良好的光声成像深度和光热治疗效应，其主要原因有三：1）肿瘤内的有效渗透与驻留：一方面，纳米颗粒在外周血中通过SR-B1受体被吞噬细胞摄取，随着吞噬细胞的肿瘤归巢特性而被运输至病灶部位实现深度渗透；另一方面，在肿瘤内扩散的纳米颗粒经由SR-B1受体被4T1肿瘤细胞和巨噬细胞摄取。由此，在双重摄取方式下实现了肿瘤内R4F-ICG@L-MSN的高效驻留。2）ICG的高效装载与光热效应提升：介孔硅-脂质纳米载体对ICG的高效装载能力，使得R4F-ICG@L-MSNs在808 nm激光照射下表现出显著提升的光声成像能力和光热效应，且性能稳定。3）光热效应诱导的抗肿瘤免疫应答：在肿瘤组织内，免疫抑制性的M2型巨噬细胞比例降低，免疫激活的成熟树突状细胞比例升高和CD8+ T细胞浸润增多。由此可见，这种智能纳米颗粒具有肿瘤靶向和深度渗透、PA成像引导的PTT以及抗肿瘤免疫应答等性能，为实体瘤治疗提供了一种可行方法，具有良好的临床转化潜力。同时，该研究也为肿瘤化疗药物或成像造影剂的高效装载与在体应用，提供了设计思路与递送新策略。
图7. R4F-ICG@L-MSNs用于深度肿瘤穿透和高效光热治疗示意图。
本研究获得国家杰出青年科学基金（81625012）、武汉光电国家研究中心创新基金（NO. 2021WNLOKF008）、海南省自然科学基金（823RC472）、海南大学科研基金（KYQD（ZR）20078、KYQD（ZR）19107）和中央高校基本科研业务费专项基金（2019kfyXMBZ022）资助。张智红教授和杨孝全教授为文章的共同通讯作者，课题组博士后王俊杰和海南大学副教授彭星舟为文章的共同第一作者，华中科技大学博士生魏剑霜、黄松林、邓得强、范展、冷月红，海南大学博士后戴艳锋和研究生艾静、蔡浈桢，以及中国科学院精密测量科学与技术创新研究院研究生丘茂松和陈世祯研究员共同参与了相关工作。
DOI: 10.1016/j.nantod.2023.101864
全文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1748013223001135?dgcid=coauthor
